Главная Лечение вич-инфекции Экспериментальные исследования препарата

Лечение вич-инфекции

Экспериментальные исследования препарата

Изучение специфической противовирусной активности препарата НН “in vitro” на модели вируса иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1)

Испытание препарата НН проводились в два этапа. На первом этапе изучалась цитотоксическая активность препарата, на втором этапе – специфическая противовирусная активность. В работе использовалась перевиваемая линия человеческих Т-клеток МТ-4, характеризующаяся высокой чувствительностью к ВИЧ-1 и лабораторный штамм ВИЧ-1 IIIВ. На всех этапах работы проводилось сравнение действия препарата НН и азидотимидина.

Результаты 3-х независимых опытов по цитотоксической активности препарата представлены в Таблице 1. На основании полученных результатов была определена 50% цитотоксическая доза (ТД50) для данного препарата, соответствующая такой его концентрации, которая на 50% снижает ростовые свойства клеток.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА НН.

Таблица 1.

№ опыта
Концентрация препарата, мкг/мл
Абсолютное число живых клеток, тыс./мл
Относительное число живых клеток в %1
Проба 1
Проба 2
Проба 3
1
 3000
182,2
217,7
248,8
66
1500
275,5
282,1
257,7
89
750
159,9
162,2
164,4
50
Без препарата
313,3
337,7
328,8
100
2
3000
666,6
608,8
662,1
106
500
637,7
539,9
595,4
102
120
459,9
573,2
513,2
89
24
615,4
584,3
606,6
103
5
544,3
431,1
482,1
84
Без препарата
575,5
526,6
655,5
100
3
3000
455,5
402,2
422,1
98
1000
428,8
499,9
475,5
108
333
495,5
464,3
473,2
110
Без препарата
435,5
424,4
442,1
100
AZT
10
175,5
204,4
188,8
37
2
273,3
291,1
255,5
62
0,4
333,3
342,2
351,1
89
0,08
371,0
364,4
357,7
112
0,016
366,6
375,5
355,5
119
0,0032
344,4
266,6
306,6
120
Без препарата
286,6
306,6
326,6
100

1 Среднее значение для трех параллельных проб. За 100% принимали среднее значение трех параллельных проб клеток, культивировавшихся в идентичных условиях без препарата.

На основании полученных результатов можно сделать следующие выводы:
  1. Препарат НН характеризуется низкой цитотоксической активностью на линии клеток МТ-4.
  2. TД50 для НН составляет 15848 мкг/мл и, таким образом, этот препарат оказывается более чем в 6000 раз менее цитотоксичным, чем азидотимидин (ТД50 для азидотимидина в условиях наших экспериментов составила 2,3 мкг/мл).
Для изучения противовирусной активности и антирепликативного действия НН в качестве чувствительных клеток к ВИЧ-1 была использована перевиваемая клеточная линия Т-лимфоцитов МТ-4. Для заражения клеток использовали стандартный лабораторный штамм ВИЧ-1 – IIIB (Gallo R.C. et al. Isolation of human T-cell leukemia virus in aquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science 1983; 220:865-867) из музея вирусных культур НИИ вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН. 

Для изучения противовирусной активности клетки МТ-4 заражали вирусом на 1-ый или 2-ой дни после пересева. Перед постановкой опытов неинфицированные свежие клетки трижды промывали ростовой стандартной культуральной средой без антибиотиков.  Для заражения клеток использовали   вирус-содержащую культуральную жидкость, которая была получена следующим образом.  Свежие клетки отмывали  три раза стандартной ростовой  средой без антибиотиков и заражали вирусом с множественностью инфекции 10 ИД50 на клетку. Через три дня инкубации в термостате при стандартных условиях клетки осаждали, собирали надосадочную жидкость, пропускали ее через мембранный фильтр 0,22нм, разливали на отдельные аликвоты, которые хранили при 700С. При постановке  опытов использовали эти аликвоты только один раз. Для трех аликвот предварительно был определен инфекционный титр, который в среднем составил 107 ИД50/мл.

При испытании противовирусной активности препаратов конечная множественность  инфекции изменялась от  1 до 0,001 ИД50 на клетку. В каждом опыте эта величина указана отдельно.

В работе было изучено влияние препаратов на инфекционную активность вируса (вирулицидное действие) и на биосинтез  вируса в клетке  (внутриклеточное действие).

Для изучения вирулицидного действия вирус-содержащую культуральную жидкость инкубировали с препаратом, затем смесь разводили и добавляли к клеткам МТ-4 так, чтобы множественность инфекции составляла 0,5 ИД50 на клетку.

При изучении влияния препаратов на размножение вируса в клетке исследуемые образцы добавляли к клеткам  до заражения, одновременно с заражением и в различное время после заражения. Инфекционная активность составляла 1 - 0,01 ИД50 на клетку.

Испытание образцов проводили в два этапа. На первом этапе (предварительном)  для оценки противовирусной активности препаратов использовали метод определения жизнеспособности клеток. На втором этапе противовирусную активность препаратов оценивали с использованием коммерческих тест-систем на р24 антиген  и вирионную РНК ВИЧ-1, позволяющих количественно оценить накопление вирус-специфических компонентов в культуральной жидкости зараженных вирусом клеток.

Используемые в работе среда RPMI1640 и вирус-содержащая культуральная жидкости не содержали антибиотиков. Для постановки опытов использовали  одноразовые пластиковые 24-луночные культуральные плашки или культуральные пробирки емкостью 15 мл. Каждая исследуемая точка содержала по три параллельные пробы.

ИЗУЧЕНИЕ ВИРУЛИЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА НН.

Таблица 2.

Образец
Количество клеток, тыс./мл
Живые клетки, %1
Проба 1
Проба 2
Проба 3
Среднее
НН,10 мг/мл
235,5
213,3
217,7
215,5
51
Контроль клеток
442,1
399,9
417,7
426,6
100
Контроль вируса
113,3
111,1
119,9
115,5
27

1 Среднее значение для трех параллельных проб. За 100% принимали среднее значение трех параллельных проб клеток, культивировавшихся в идентичных условиях без препарата.

Как видно из таблицы 2, препарат проявляет противовирусную активность, при этом концентрация препарата 10 мг/мл оказывается близка к 50% эффективной дозе (ЭД50).

При изучении антирепликативного действия кетки (500000 клеток/мл) по 1 мл вносили в лунки 24-луночных культуральных плашек, добавляли по 0,1 мл вирус-содержащей культуральной жидкости. При этом инфекционные дозы составляли 0,01 ИД50/кл или 0,02ИД50/клетку. Затем пробы инкубировали в термостате в стандартных условиях 2 часа и затем вносили по 0,3 мл препарата до конечной концентрации 3 мг/мл. Плашки помещали в термостат и учет  результатов проводили через 96 часов по методике, указанной ранее. Препарат вносили через два часа после заражения клеток вирусом. Результаты опыта представлены в таблице 3.

ИЗУЧЕНИЕ АНТИРЕПЛИКАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТА НН.

Таблица 3.

Образец
Жизнеспособность клеток в % к контролю (клетки без добавления вируса)
0,02 ИД50 на клетку
0,01 ИД50 на клетку
НН, 3 мг/мл
92
108
Азидотимидин, 0,1 мкг/мл
103
112
Контроль вируса
59
50
Контроль клеток
100
100

* Жизнеспособность клеток определяли как описано ранее, представлено среднее значение трех независимых проб.

Из таблицы 3 видно, что при данных условиях эксперимента препарат НН проявляет противовирусную активность, сравнимую с активностью азидотимидина в концентрации 0,1 мкг/мл.

Для дальнейшего количественного изучения противовирусного действия препарата клетки МТ-4 ( 80-100 мл)   через 24 или 48 часов после пересева осаждали при 500 об./мин. в течение 7 мин., осадок промывали трижды ростовой культуральной средой без антибиотиков. Осадок клеток суспендировали  в  5-7,5 мл среды в зависимости от исходной концентрации клеток,  но так, чтобы их концентрация  соответствовала 107 кл./мл, затем к ним добавляли 1/10 часть стандартной вирус-содержащей культуральной жидкости в разведении 1:10. Таким образом, множественность инфекции составляла 0,01 ИД50/кл., и далее использовали один из следующих вариантов постановки опыта:
  1. Клетки с вирусом помещали в термостат и инкубировали,  помешивая  каждые 15-20 мин.  Через 90 мин. клетки промывали три раза 100-кратным объемом свежей среды, чтобы избавиться от свободного, не проникшего в клетки вируса, затем разливали клетки в отдельные культуральные  одноразовые пробирки,  вносили препараты соответственно схеме испытаний и культивировали далее в термостате в стандартных условиях.
  2. Клетки с вирусом разливали по 1 мл в культуральные  пробирки объемом 15 мл, вносили препараты соответственно схеме опыта и помещали их в термостат для инкубации в стандартных условиях. Через 18 часов клетки каждой пробы отмывали три раза 100-кратным объемом культуральной среды, суспендировали их затем в свежей среде при соответствующей концентрации препарата по схеме опыта и помещали в термостат. Через 96 часов после заражения в обоих случаях клетки осаждали при 1000 об./мин. 10 мин., отбирали надосадочную жидкость и  использовали её затем для оценки накопления в ней белка р24 ВИЧ-1.   Часть проб использовали для дополнительного анализа накопления в них РНК ВИЧ-1. Каждая  исследуемая точка  включала по три параллельные пробы.
В первом опыте образец № 1 препарата НН в конечной концентрации 3мг/мл  вносили через 0, 1, 4  и 18 часов после заражения клеток. При определении полуколичественной концентрации накопления белка р24 в пробах готовили их серийные  десятикратные разведения. Для анализа использовали 0,1 мл  каждого из полученных разведений. Полученные результаты представлены в таблице 4.

КОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА НН. КОНЦЕНТРАЦИЯ ПРЕПАРАТА 3 мг/мл.

Таблица 4.

Время внесения препарата после заражения (ч)
  Количество
Белка    р24
ВИЧ-1
( мкг/мл )
0
28±3
1
42±4
4
31,25±5
18
41,5±7
Без препарата
1600±54

Культуральная жидкость проб из представленных выше опытов,  в которых по показаниям  р24 белка ВИЧ-1 наблюдалась наилучшая противовирусная активность, были изучены на наличие  в них количества копий РНК  с помощью тест системы AMPLICOR HIV-1 MONITOR.
Результаты анализа представлены в Таблице 5.

ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕПАРАТА НН.  ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧИСЛА КОПИЙ РНК ВИЧ-1.

Таблица 5.

Образец
Концентрация препарата (мг/мл)
Количество копий РНК ВИЧ-1/мл
НН
3
440000
НН
3
440000
НН
1,5
440000
Без препарата
0
1200000

Из данных Таблицы 5 следует, что препарат, исследованный с помощью тест-системы AMPLICOR HIV-1 MONITOR, демонстрируют выраженную противовирусную активность. Полученные данные полностью согласуются с результатами определения р24 ВИЧ-1 и числа жизнеспособных клеток, представленными выше. Однако важно подчеркнуть, что при оценке содержания вирус-специфической РНК противовирусный эффект всех препаратов оказывался существенно ниже, чем в тех случаях, когда оценка их действия проводилась с помощью подсчета жизнеспособных клеток или определения содержания р24 в культуральной среде. Наиболее вероятным объяснением этого феномена может быть особенность тест-системы, предназначенной для определения числа копий РНК ВИЧ-1, связанная с ее неспособностью фиксировать столь незначительные отличия в содержании РНК ВИЧ-1 (по данным, приведенным в инструкции фирмы-изготовителя, допускается десятикратный разброс значений числа копий вирус-специфической РНК в пределах одного измерения).

Таким образом,  можно сделать вывод о том, что препарат НН обладает выраженной противовирусной активностью. В таблице 6 мы приводим суммарные данные о цитотоксической и противовирусной активности препарата.

СУММАРНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТИ НН В СРАВНЕНИИ С АЗИДОТИМИДИНОМ.

Таблица 6.

Препарат
ТД50
ЭД50
Индекс селективности (ТД50/ЭД50)
НН
15848 мкг/мл
1500±600 мкг/мл
10,5±3,2
Азидотимидин
2,3 мкг/мл
0,0017±0,0008 мкг/мл
1353±456

Как следует из данных таблицы, индекс селективности препарата НН  более чем в 100 раз ниже, чем азидотимидина в условиях наших экспериментов, однако ТД50 почти в 7000 раз выше. Противовирусный эффект может объясняться, как минимум, двумя причинами. Во-первых, препарат может взаимодействовать с белками наружной оболочки вируса или рецепторами клетки-хозяина, которые участвуют в адсорбции, и, таким образом, снижать эффективность ранних этапов инфекции. Во-вторых, препарат  может  взаимодействовать с какими-либо рецепторами  клетки-хозяина, которые участвуют в передаче сигналов,   регулирующих транскрипцию  клеточного генома и синтез определенных белковых продуктов, которые, в свою  очередь,  могут  оказывать влияние на репликацию вируса, в данном случае подавлять её. Последнее объяснение представляется нам более вероятным.

Суммируя данные определения числа жизнеспособных клеток, белка р24 ВИЧ-1 в культуральной жидкости, а также числа копий вирус-специфической РНК в культуральной среде, можно сделать вывод о том, что препарат НН оказывается способным подавлять репродукцию вируса ВИЧ-1 штамма IIIB в чувствительных клетках МТ-4. При этом 50% -ная эффективная доза препарата находилась в пределах 0,9-2,1 мг/мл. Препарат обладает низкой цитотоксичностью. Расчетное значение ТД50 составило 15,85 мг/мл. Необходимо также отметить, что наибольший противовирусный эффект достигался при внесении препарата только через некоторое время после заражения чувствительных клеток. В связи с этим можно предположить, что его противовирусное действие может происходить путем связывания с определенными сигнальными рецепторами на клеточной поверхности, вовлеченными в негативную регуляцию размножения вируса. Важно также подчеркнуть относительную нестабильность данного препарата при инкубации  в культуральной жидкости, однако этот недостаток не представляется нам существенным, так низкая цитотоксичность препарата, по-видимому, позволит поддерживать достаточно высокие его концентрации в организме.

Сайт разработан в imaxmedia.ru
Copyright © 2019 ОАО «Аполлон»
Все права защищены
ОАО «Аполлон»
121471, г.Москва, ул. Рябиновая, дом 43

Тел.: +7 (495) 609 1118,
Факс: +7 (495) 792 7618

info@pharmek.ru